保持手術間“相對密閉狀態”，保證空氣的潔凈度：應保持層流手術室物品相對固定，盡量減少工作人員進出次數。常規用的手術耗材、液體、藥品等均在層流手術室的玻璃墻柜中分類放齊、放全，位置相對固定，保持基數；把與手術相關的各種儀器如電刀、顯微鏡、腹腔鏡等固定在手術間，各類物品分類、分規格擺放，標識清楚，使物各有位、過目知數、一目了然。 每天專人負責檢查及添置室內物品并登記；手術人員及參觀者進入手術室后，盡量減少走動，各項動作要輕柔，勿在手術室抖動各種敷料。手術過程中保持前后門關閉，以避免頻繁開關時空氣流動污染；盡量避免一位巡回護士同時巡回多臺手術，保證手術間處于相對封閉狀態。
強化清潔管理，減少各種污染的機會：層流手術室的一切清潔工作必須采用濕拭打掃，在凈化空調系統運行中進行。每天早晨濕拭并用消毒液擦拭手術室的物品，濕拭拖地并用消毒液擦洗墻面。層流手術室地面保持整潔，術中如有血液、體液濺到儀器或地面，及時用浸濕消毒液的抹布擦拭；手術間設有尖銳物收集箱、感染類垃圾收集袋及非感染性垃圾收集袋，術中產生的垃圾分類放置，術后集中處理，每臺手術結束后器械護士將污染敷料置于污物車內，由工人從污物通道運出，減少對地面的污染，減少污物在室間停留時間；每次手術完畢用消毒液擦拭手術間的無影燈、器械臺、手術床、床墊和體位墊及其他物品表面，并用消毒液濕拭清潔地面。每周進行徹底的清潔工作，不同級別的層流手術室使用各自專用的拖把以防止交叉感染，并用500 mg/L的含氯消毒劑浸泡消毒。每星期清洗初效過濾網1次，出風口1次，并用消毒液擦拭回風口過濾網。中效、高效過濾網每2年更換1次。 塑膠地板定期請清潔公司用專業單圓機清洗加打蠟。每月對潔凈手術室內空氣潔凈度和物體表面進行細菌監測。
加強出入口的管理：在層流手術室大門及無菌區入口處鋪設易清洗且可用消毒液浸泡的地墊，每日更換，這將對進出的推車及其車輪起到除塵和消毒作用。設立交換廳，嚴格區分室內車、室外車，病人由病人通道入室，進出必須更換交換車。每日增加交換區清潔地面的次數。
